На правах рукописи

Беловежец Людмила Александровна

микробиологические и экологические аспекты переработки вторичного лигноцеллюлозного сырья

03.00.16 – экология

Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата 
биологических наук

Иркутск - 2007

Работа выполнена в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН

Научный руководитель:					кандидат биологических наук,
									старший научный сотрудник
Волчатова Ирина Владимировна

Официальные оппоненты:					доктор биологических наук,
									профессор
									Стом Дэвард Иосифович
доктор биологических наук,
профессор
Илли Иван Экидиусович
Ведущая организация:					Сибирский институт физиологии и
биохимии растений СО РАН

Защита состоится « 23 »   мая   2007 г. в 13 час на заседании диссертационного совета 
Д 212.074.07 при ГОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу: 
г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. проф. М.М. Кожова (ауд. 219).

Отзыв просим направлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 664003, Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет ИГУ, e-mail: decanat@bio.isu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского 
государственного университета.

Автореферат разослан «      »                         2007 г.   
Ученый секретарь диссертационного                      Е.С. Купчинская
совета, к.б.н.								
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Россия является одной из ведущих стран мира по объему заготавливаемой древесины. При существующих способах переработки древесного сырья в целом по России полезно используется около половины, а в сибирском регионе - лишь третья часть биомассы дерева. Объем отходов в стране чрезвычайно велик. Например, на полигонах гидролизных заводов только Иркутской области находится свыше 2 млн. т ГЛ. Несмотря на пригодность ГЛ для получения полезных продуктов, он вывозится на свалки, занимая значительные площади, и даже приводит к пожароопасным ситуациям, т.к. способен самовозгораться. Вымываемые атмосферными осадками кислые агенты мигрируют в почву, а далее – в грунтовые воды, создавая угрозу обширного загрязнения прилегающей к предприятиям территории. Необходимость утилизации отходов лесоперерабатывающей промышленности является одной из важнейших экологических проблем. 
В литературе имеется значительное количество работ, посвященных биоконверсии лигноцеллюлозных субстратов с целью создания средозащитных технологий их утилизации, однако экологические аспекты происходящих при этом процессов практически не освещены. Наиболее оправданным способом утилизации древесных отходов с этой точки зрения является использование их в качестве удобрения. 
Ранее в лаборатории природных синтонов и лигандов ИрИХ СО РАН был разработан способ ускоренного компостирования ГЛ с минеральными добавками при активном участии специально составленной непатогенной микробной ассоциации, участвующей в биотрансформации и гумификации исходного субстрата. Показана его эффективность для повышения урожайности сельскохозяйственных растений. В то же время остались не решенными вопросы, касающиеся возможности управления процессом компостирования, вклада компонентов компоста и микроорганизмов закваски в общий эффект удобрения, оценки перспективы расширения сферы исходных субстратов. 
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение микробиологических и биохимических процессов, происходящих при компостировании древесных отходов (гидролизного лигнина и древесных опилок), и исследование биологической активности готового продукта и его компонентов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- исследовать изменения микробиологического состава созревающего компоста на основе ГЛ и найти достоверные методы контроля его готовности;
- выявить взаимосвязь происходящих в созревающем компосте микробиологических и биохимических процессов с агрохимическими показателями удобрения; 
- изучить действие компоста, полученного в результате биоконверсии ГЛ, на урожай сельскохозяйственных культур;
- выявить действующее начало удобрения на основе ГЛ, оценить влияние различных его компонентов на микроорганизмы и ферменты почвы, а также на рост и развитие сельскохозяйственных культур; 
- определить ферментативную активность грибов, выделенных из ГЛ, и их потенциал для биодеградации ГЛ; 
- провести скрининг микроорганизмов, обладающих высокой активностью при разложении опилок;
- изучить фитогормоны, образуемые грибами – агентами компостирования, определить их физиологическую активность по отношению к сельскохозяйственным растениям. 
Научная новизна. Исследована микробная сукцессия, принимающая участие в компостировании гидролизного лигнина. Впервые для энзимоиндикации зрелости компоста применено определение активности оксидоредуктаз. Выделены новые перспективные культуры, отличающиеся высокой скоростью утилизации соединений, моделирующих фрагменты и связи лигнина, и Mn-пероксидазной активностью, улучшающие гумификацию ГЛ. Проведен скрининг дереворазрушающих микроорганизмов и создана их ассоциация, способная компостировать древесные опилки. Выявлен вклад отдельных компонентов компоста и микроорганизмов закваски в биологическую активность готового продукта. Впервые исследован фитогормональный потенциал дереворазрушающих грибов - агентов компостирования.
Практическая значимость работы. Изучены экологические аспекты биотрансформации ГЛ в удобрение и применения его в сельскохозяйственной практике. Разработан метод энзимоиндикации зрелости лигнокомпостов. В полевых испытаниях показана эффективность лигнокомпоста для повышения урожайности зерновых культур и картофеля. Составлена ассоциация дереворазрушающих микроорганизмов для компостирования опилок. Среди исследованных грибов выделены продуценты фитогормонов растений, показано действие их культуральных фильтратов на рост и развитие сельскохозяйственных растений.
Апробация работы. Работа докладывалась и обсуждалась на региональных и международных конференциях «Проблемы экологии» (Иркутск, 1999), Российской научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002), межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), Международной школе молодых ученых и специалистов «Перспективные технологии для современного сельскохозяйственного производства» (Курск, 2005), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск - Раков, 2006).
Работа выполнена в соответствии с планом НИР Иркутского института химии им. А. Е. Фаворского СО РАН по теме: «Развитие химии и глубокой переработки древесины: получение новых биологически активных и технически ценных продуктов для медицины, сельского хозяйства и критических технологий» (№ государственной регистрации 0120.0 46380) и при финансовой поддержке РФФИ (грант № 05-04-97-269).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 151 страницах, содержит 25 рисунков и 29 таблиц. Список литературы включает 218 источников, из них 100 работ зарубежных авторов. 

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Обобщены литературные данные о существующих способах переработки древесных отходов. Показаны перспективы перевода этих отходов в удобрение путем их компостирования. Проанализирована литература, описывающая процессы, происходящие при компостировании, участвующие при этом микроорганизмы, способы оценки зрелости готового продукта. 

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исходным материалом для приготовления удобрения служил ГЛ, взятый сразу после стадии гидролиза древесины (Зиминский гидролизный завод). Состав ГЛ (%): целлюлоза – 10.1, лигнин – 62.1, зола – 5.4, влажность – 75, рНвод. 2.8, рНКCl  2.55. При компостировании на 3 т ГЛ вносили 36 кг извести, 27 кг аммофоса, 21 кг калия хлористого, 75 кг сульфата аммония и 50 кг закваски (Волчатова, 2000). 
В состав закваски входили Trichosporon cutaneum (beigelii) D-46, T.cutaneum 5, Streptomyces asterosporus, предоставленные чл.-корр. НАН Беларуси Э.И. Коломиец (институт микробиологии НАН Беларуси, г. Минск), Penicillum citreo-viride, Cephalosporium (Acremonium) sp., Phanerochaete chrysosporium Burds. 1 MR-1, предоставленные д.б.н. Тен Хак Муном (институт водных и экологических проблем ДВО РАН, г. Хабаровск). Культуры выращивали на жидких средах в течение 5 суток (Т. cutaneum - на среде для дрожжеподобных грибов (Коломиец, 1990), S. asterosporus - на среде для лигнинолитических актиномицетов (McCarthy, 1984), P. сhrysosporium, P.citreo-viride, Cephalosporium sp. - на среде Кирка для грибов (Kirk, 1978)). 
Численность микроорганизмов и активность ферментов определяли по стандартным методикам (Егоров, 1995; Хазиев, 1990). Фитотоксичность созревающего компоста определяли по прорастанию семян пшеницы. Полевые опыты осуществляли в 1999-2001 гг. на светло-серых лесных почвах учебно-производственного участка Иркутской государственной сельскохозяйственной академии с ячменем Неван, пшеницей Ангара-86, кукурузой Коллективный 100 СВ, картофелем Невский. 
Выделение пионерных микроорганизмов проводили из ГЛ (контрольный опыт по компостированию). В качестве модельных соединений лигнина использовали ванилин, пирокатехин, ванилиновый спирт, гваяцилпропанол-1, вератровый спирт, сиреневую кислоту. Состав метаболитов анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Милихром-1 (Россия) на колонке, заполненной сорбентом Сепарон С18. В качестве элюента использовали 40-процентный раствор метанола в 0.01 М КН2РО4, подкисленном Н3РО4  до рН 3.9. Детектирование осуществляли при λ 280 нм.

Н2О, 24 оС
1 сутки
фильтрование

КОМПОСТ

     

водная 

твердая фаза

Н2SO4 до рН 1
экстракция
эфиром

NaOH 0.5 %
1 сутки

                                                                  	

фенолы (1)

щелочь

H2SO4 до рН=1
фильтрование

твердая фаза (5)

водная (6)

                              	

водная

лигногуминовые
вещества (4)

экстракция
эфиром
экстракция

                                                                                                                          

эфирная

водная 

NaHCO3, 10%

                                                                          

кислоты

фенолы (2)

H2SO4 до рН 2
экстракция
эфиром

	  

феноло-
кислоты (3)

водная (7)

Рис. 1. Схема фракционирования компоста

Для фракционирования использовали готовый компост (3 месяца компостирования). Фракционирование проводили по схеме (рис. 1). Вегетационные опыты с выделенными фракциями и культуральными фильтратами грибов проводили на семенах пшеницы, ячменя, кукурузы и гороха. Результаты всех опытов обрабатывали дисперсионным методом анализа (Доспехов, 1985).
Скрининг проводили среди дереворазрушающих грибов микробиологической коллекции лаборатории природных синтонов и лигандов ИрИХ СО РАН.  Компостирование свежих опилок осуществляли в лабораторных условиях. Состав опилок (%): целлюлоза – 47.6, лигнин – 31.9, влажность – 10.9, рНвод. 5.6, рНКCl. 5.9.  Для компостирования использовали грибы Trametes versicolor (L.: Fr.) Pilat, предоставленный Д.И. Стомом (НИИ биологии при ИГУ, г. Иркутск), Phanerochaete chrysosporium Burds. ATCC-24725 (ВНПО Гидролизпром, г. Санкт-Петербург), Sporotrichum pulverulentum (конидиальная стадия P. chrysosporium) Novobr. 1766 и 1767 (ВКМ, г. Пущино), Cephalosporium sp. и  P. chrysosporium 1 MR-1 (Институт водных и экологических проблем ДВО РАН, г. Хабаровск).
Компостирование проводили в течение 4 месяцев в термостатируемых условиях (26 оС). В компосте определяли убыль лигнина и целлюлозы компостной массы, индекс ксилолиза, фитотоксичность, соотношение С/N готового компоста. 
Изучение гиббереллиноподобной активности (ГПА) проводили по удлинению гипокотилей салата и по эндоспермальному тесту на беззародышевых половинках семян ячменя. Для стимуляции образования ауксинов культурами, используемыми для компостирования, как ГЛ, так и опилок, в соответствующую питательную среду добавляли D,L-триптофан в концентрации 200 мг/л. Количество ауксинов определяли по методу Сальковского (Чумаков, 1992), а их активность - по подавлению прорастания семян горчицы сарепской (Методы определения, 1978)  и по интенсивности укоренения черенков фасоли (Возняковская, 1969). 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Деградационная сукцессия в ходе компостирования гидролизного лигнина и анализ конечного продукта
Анализ динамики температуры в полупромышленном эксперименте показал, что подъемы температуры наблюдались в первую неделю компостирования и после перемешивания (через 3, 7, 10 недель после начала компостирования). Отсутствие температурной реакции компоста на перемешивание (13 нед) указывало на окончание ферментации.
Микробиологический анализ компоста выявил большое количество микроорганизмов практически всех исследованных физиологических групп уже в начале компостирования. Лишь увеличение численности нитрификаторов происходило постепенно. При этом сначала размножались бактерии, окисляющие аммиак, и только к 6 нед появлялись бактерии, окисляющие нитриты. Максимумы количества аэробных целлюлозолитиков и термофилов коррелировали с максимумами температуры (рис. 2). 
Общее количество микроорганизмов стабилизировалось к 3 мес компостирования, оставаясь на достаточно высоком уровне, то есть к данному периоду создалось устойчивое микробное сообщество, что может служить показателем готовности компоста.

			А								Б
Рис.2. Динамика количества термофилов, аэробных целлюлозолитиков (А) и изменение активности гидролаз (Б) в процессе компостирования гидролизного лигнина

Исследование активности ферментов выявило высокую активность оксидоредуктаз уже на второй неделе ферментации (рис. 3). В течение всего срока эксперимента уровень оксидазной активности коррелировал с изменением температурного режима компостирования. По мере созревания компоста активность ферментов этого класса снижалась почти до нуля.
Иначе изменялась активность гидролаз, в частности, инвертазы. Ее активность, возрастала после 6 нед компостирования и стабилизировалась к 13 нед. Максимумы целлюлазной активности совпадали с максимумами температуры и количеством аэробных целлюлозолитиков (рис. 2). 
Исследование фитотоксичности созревающего компоста показало, что максимальная токсичность совпадала по времени с первыми максимумами активности пероксидазы и полифенолоксидазы через 2 нед компостирования. Отсутствие фитотоксичности отмечено к 13 нед компостирования. Таким образом, о степени готовности удобрения, кроме отсутствия фитотоксичности, свидетельствовало снижение активности оксидоредуктаз (наиболее целесообразно определение активности полифенолоксидаз) и стабилизация активности инвертазы. 

                  	  А                                          		      		 Б
Рис.3. Изменение активности оксидоредуктаз в процессе компостирования гидролизного лигнина: А - пероксидазы, полифенолоксидазы, Б - каталазы 

Агрохимический анализ созревающего компоста выявил увеличение количества гуминовых кислот, подвижных форм азота и фосфора в течение всего срока компостирования (табл. 1).
Ранее было показано, что компост малого срока компостирования по своим удобрительным свойствам мало отличается от ГЛ, поэтому в рамках данной работы полевые опыты проводили с образцами со сроком компостирования свыше двух месяцев.
В ходе испытаний 10-13-недельного компоста в дозе 10 т/га выявлено повышение урожайности пшеницы и ячменя в среднем на 130 % и 67 %. Большой активностью обладал также годичный компост. Исходный ГЛ, как сам по себе, так и с минеральными добавками в дозе, соответствующей таковой компоста, не оказывал достоверного влияния на урожай исследованных культур. 
Анализ данных по урожайности зеленой массы кукурузы показал, что внесение лигнинового компоста в дозе 60 и 30 т/га дает прибавку 215 и 135 % соответственно, с улучшением качественных показателей продукции. Перегной в тех же дозах и сложное минеральное удобрение обеспечивали меньшее повышение урожайности. Содержание тяжелых металлов во всех вариантах не превышало допустимой концентрации. 

Таблица 1 
Агрохимические показатели гидролизного лигнина и компоста на его основе
Срок
компостирования	Гуминовые кислоты, %	Подвижные формы, мг/100 г	
		N-NО3	N-NН4	Р2О5	
ГЛ	6.2	0.9	12	40	
ГЛ + минеральные добавки	6.2	2.5	1020	700	
Компост 4 нед	7.8	148	750	1000	
Компост 8 нед	9.1	208	920	1150	
Компост 12 нед	10.2	293	980	1200	

Таким образом, исследования показали, что развитие деградационной сукцессии в процессе компостирования гидролизного лигнина сопровождается появлением микроорганизмов различных физиологических групп и отличается от контроля более ранним появлением актиномицетов. На основании динамики ферментативной активности микробного сообщества разработан метод энзимоиндикации зрелости компоста с учетом специфики субстрата. Полевыми опытами выявлено, что полученный компост достоверно увеличивает урожайность сельскохозяйственных культур. 

2. Биологическая активность компонентов лигнокомпоста
Фракционирование компоста (рис. 1) позволило провести сравнительный анализ биологической активности отдельных групп соединений, входящих в состав компоста.  
Предпосевная обработка семян пшеницы водными растворами фракций показала неоднозначные результаты. Водные фракции (6, 7), содержащие углеводы и аминокислоты, фенолы (фракция 1) и лигногуминовые вещества положительно влияли на ее рост, тогда как воздействие фенолов (фракция 2) и фенолокислот (фракция 3) приводило к снижению массы растений. Проростки ячменя оказались наиболее отзывчивыми на обработку лигногуминовыми веществами и фенолами (фракция 1). Основной эффект проявлялся в увеличении массы как ростка, так и корня. Все исследуемые фракции ингибировали рост стебля и корневой системы кукурузы. 
Внесение твердого остатка в почву (соотношение почва:(5) - 3:1) увеличивало среднюю длину и массу надземной части всех используемых сельскохозяйственных культур (рис. 5). Максимальный прирост наблюдался у проростков пшеницы (превышение длины на 60 %, массы – на 66 %). Развитие корневой системы было наиболее показательно для кукурузы, где средняя длина корня сравнима с контролем, а масса превышала его на 123 % за счет развития боковых корней и утолщения центральных. 
При однократной обработке почвы экстрактами из компоста наблюдалось увеличение в почве количества микроорганизмов. Прирост количества бактерий был невысокий, но стабильный для всех фракций. Максимальный прирост бактерий отмечен при обработке почвы фенолами (фракция 1). Большой отклик на обработку почвы экстрактами из компоста был выявлен в группе грибов: их количество возросло на 12-25 %. Более других веществ компоста рост грибов стимулировали фенолокислоты. Влияние фракций на количество актиномицетов различно. Лишь лигногуминовые вещества и водная фракция 7 увеличивали их количество, тогда как в остальных случаях положительного действия не наблюдалось. 

Рис. 5. Влияние твердой фракции на рост растений
Таким образом, среди всех выделенных фракций наибольшими удобрительными способностями обладали лигногуминовые вещества, фенолы (фракция 1) и твердый остаток. Положительное действие лигногуминовых веществ и фенолов (фракция 1) связано со стимуляцией биохимических процессов в семени растения, а эффект твердого остатка проявлялся за счет структурирования почвы и повышения ее влагоемкости. 
Нами было исследовано физиологическое действие микроорганизмов закваски на рост и развитие растений, количество микроорганизмов почвы и ее ферментативную активность
Суммарная ГПА была обнаружена у всех грибов, за исключением дрожжеподобных. Ауксиновая активность микроорганизмов оказалась индуцибельной: при выращивании микроорганизмов на средах без триптофана фитогормоны этого класса обнаружены не были. Добавление аминокислоты к среде приводило к стимуляции синтеза ауксинов у четырех культур из пяти. Во всех экстрактах идентифицирована β-3-индолилуксусная кислота, а у дрожжеподобных грибов еще и γ-(3-индолил)-масляная кислота. Высокая физиологическая активность выделяемых ауксинов подтверждалась биотестами. 
Обработка культуральными фильтратами семян ячменя привела к достоверному увеличению средней длины корней на 12-32 %, а массы – на 28-78 %. Индукция ауксинов в культуральных фильтратах не изменила общей картины. Таким образом, существенного влияния ауксинов на развитие ячменя отмечено не было.
Влияние обработки культуральными фильтратами семян пшеницы в основном проявлялось в увеличении массы корней (до 63 %). Внесение в питательную среду триптофана инициировало синтез ауксинов, что, в конечном счете, заметно усилило стимулирующий эффект (превышение над контролем до 80 %). Культуральные фильтраты исследуемых культур ингибировали рост стебля и корневой системы кукурузы. Исключением стал культуральный фильтрат  T.cutaneum 5, воздействие которого привело к увеличению массы корней на 28 % за счет развития боковых корней. 
Влияние культуральных фильтратов на количество микроорганизмов почвы имело четко выраженную зависимость от типа воздействующего организма. Так, культуральный фильтрат грибов достоверно увеличивал численность почвенных бактерий и актиномицетов. Действие же актиномицета S.asterosporus проявлялось исключительно в увеличении численности грибов. Культуральные фильтраты дрожжеподобных грибов положительно влияли на количество всех трех основных групп микроорганизмов. 
Таким образом, культуральные фильтраты исследованных лигнинолитических микроорганизмов активизируют рост почвенных бактерий и грибов, стимулируют развитие ячменя и пшеницы благодаря присутствию биологически активных веществ, интенсифицирующих обменные процессы в семенах растений. Основной эффект направлен на увеличение количества боковых корней. 

3. Перспективы использования пионерных штаммов грибов – колонизаторов древесных отходов для компостирования гидролизного лигнина
В ходе изучения деградационной сукцессии, протекающей при компостировании ГЛ, из контрольного бурта нами было выделено 46 изолятов пионерных микроорганизмов. Проведен их первичный скрининг по способности расти на среде с ГЛ в виде единственного источника углерода. По скорости роста и накопления биомассы для дальнейшего исследования были отобраны 8 грибных культур, определенных как Penicillium cyclopium Westling (2 штамма) и Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfelt et Nirenberg (6 штаммов). Это культуры грибов - сапротрофов, в природных условиях способных колонизировать практически любой органический субстрат. Несмотря на то, что обычно они питаются легкодоступными веществами субстрата, их считают способными довести процесс деструкции до конца, и, следовательно, они могут оказаться перспективными при компостировании.  При этом они должны иметь хорошо развитый ферментативный аппарат, включающий ферменты как целлюлазного, так и оксидоредуктазного типов.
Целлюлазная активность всех выделенных штаммов характеризовалась наличием двух максимумов (на 6-9 и 14-16 сут культивирования). Особенно выделялся Р. cyclopium 6, проявлявший целлюлазную активность, существенно (в 5-15 раз) превышающую активность остальных культур. 
Среди оксидоредуктаз была выявлена только Mn-зависимая пероксидаза. По динамике Mn-пероксидазной активности все штаммы были разделены на две группы. Первая группа (T. asperellum 4, T. asperellum 7, T. asperellum 10, T. asperellum 11, Р. cyclopium 6, Р. cyclopium 9) имела два четких максимума активности: на 5-7 и 13-15 сут культивирования. Первый максимум соответствовал началу фазы экспоненциального роста, а второй – фазы споруляции. Вторая группа (T. asperellum 3, T. asperellum 8) характеризовалась тремя максимумами активности: 8, 13-14, 18 сут. Наибольшей суммарной Mn-пероксидазной активностью обладали T. asperellum 8, T. asperellum 10 и T. asperellum 11. Известно, что Mn–пероксидаза является ключевым ферментом некоторых грибов и играет при этом важную роль в разложении лигнина. Для оценки перспектив использования выделенных культур в компостировании необходимо выявить их способность к деградации этого биополимера. В связи с трудностями изучения разрушения грибами самого лигнина исследования проводили на соединениях, моделирующих его структурные фрагменты.
Все исследованные культуры включали в метаболизм соединения со свободной фенольной гидроксильной группой (ванилин, пирокатехин, ванилиновый спирт, гваяцилпропанол-1). Максимальная скорость утилизации субстратов наблюдалась на 3-5 сут с полным их исчезновением на 8-24 сут в зависимости от штамма. Сиреневая кислота проявляла резистентность к биотрансформации всеми исследованными штаммами. Соединение с замещенной фенольной гидроксильной группой (вератровый спирт) подвергалось утилизации со значительно меньшей скоростью. 
По скорости утилизации фенольных субстратов и активности Mn-зависимой пероксидазы были отобраны 3 наиболее перспективные культуры для компостирования лигноцеллюлозных отходов (T. asperellum 3, 10, 11). Эти штаммы были проверены на совместимость с микроорганизмами закваски. По совокупности данных лучшей была признана культура T. asperellum 3.
Лабораторное компостирование ГЛ, проведенное с добавлением в разработанную ранее закваску штамма T. asperellum 3, показало, что компост, полученный с использованием модифицированной закваски, характеризуется большим содержанием гуминовых кислот и большей убылью лигнина. 
Таким образом, введение в компостную закваску T. asperellum позволило повысить степень гумификации удобрения на основе гидролизного лигнина без изменения  срока компостирования.

4. Компостирование опилок: скрининг культур и их физиологическая активность 
Гидролизный лигнин – специфический продукт, наличие которого обусловлено существованием в регионе гидролизно-спиртовых предприятий. Более распространенными являются отходы деревообработки: опилки, кора, щепа, которые также зачастую не используются. 
Несмотря на общее, по сути, происхождение гидролизного лигнина и опилок, проведенные нами исследования показали, что биотрансформация последних с достаточной для биотехнологии скоростью культурами, используемыми для компостирования ГЛ, не происходит. 
Для скрининга был взят 21 штамм высших грибов, относящихся к разным классам. Основным критерием отбора была скорость роста на опилках, изменение их внешнего вида (почернение древесных остатков и изменение их текстуры). В результате были выбраны 6 культур, из которых в соответствии с совместимостью составлены варианты для испытаний: 
1. T.versicolor, S.pulverulentum 1767, P.chrysosporium 1 MR-1, Cephalosporium sр.
2. T. versicolor, S. pulverulentum 1766, S. pulverulentum 1767, P. chrysosporium 1 MR-1, Cephalosporium sp.
3. T. versicolor, S. pulverulentum 1767, Cephalosporium sp., P. chrysosporium ATCC 24725, P. chrysosporium 1 MR-1.
4. T. versicolor, S. pulverulentum 1766, S. pulverulentum 1767, Cephalosporium sp., P. chrysosporium ATCC 24725, P. chrysosporium 1 MR-1. 
Как видно из таблицы 2, в процессе компостирования происходила деструкция и лигнина, и целлюлозы. Убыль обоих компонентов находилась в интервале от 18 до 31 %. Компосты (за исключением варианта 4) не обладали фитотоксичностью. По совокупности параметров наилучшим был признан вариант 3.
Таким образом, по результатам скрининга и совокупности химических и биологических исследований выбрана композиция, способная к биотрансформации опилок и наиболее эффективно воздействующая на субстрат.

Таблица 2 
Влияние микробиологического состава закваски на показатели компоста
Вариант	Убыль	Индекс ксилолиза	С/N	Фитотоксичность
(% проросших семян)	
	лигнина, %	целлюлозы, %				
1	20.4	27.6	0.57	22.9	86	
2	22.4	27.8	0.55	25.5	82	
3	25.1	31.5	0.56	17.5	86	
4	18.7	27.9	0.60	23.3	56	
Примечание. Количество проросших семян в контроле – 76 %

Выводы
1.	Показано, что развитие деградационной сукцессии в процессе компостирования гидролизного лигнина сопровождается появлением микроорганизмов различных физиологических групп и отличается более ранним появлением актиномицетов. Динамика аэробных целлюлозолитических и термофильных микроорганизмов коррелирует с изменением температуры. 
2.	Разработан метод энзимоиндикации зрелости компоста, основными критериями которого являются: снижение активности оксидоредуктаз, стабилизация активности инвертазы и снижение фитотоксичности до уровня фитотоксичности почвы. 
3.	Доказано, что благодаря микробиологической закваске в процессе компостирования происходит направленный рост количества гуминовых кислот, подвижных форм азота и фосфора. 
4.	Показано стимулирующее действие культуральных фильтратов исследованных лигнинолитических микроорганизмов и фракций компоста на рост и развитие ячменя и пшеницы, а также целлюлазную и лакказную активность почвы. 
5.	Выявлен фитогормональный потенциал ассоциации микромицетов: способность секретировать физиологически активные вещества гиббереллиновой и ауксиновой природы, аналогичные фитогормонам растений. Для синтеза ауксинов культурам необходимо присутствие в питательной среде триптофана. 

6.	Среди пионерных микроорганизмов-деструкторов древесных отходов отобраны штаммы Trichoderma asperellum и  Penicillium cyclopium, проявляющие высокую целлюлазную и Mn-пероксидазную активности. Введение в компостную закваску культуры T. asperellum повысило степень гумификации гидролизного лигнина без изменения срока компостирования.
7.	В результате проведенного скрининга дереворазрушающих грибов создана ассоциация макромицетов, способная в короткие сроки эффективно деструктировать древесные опилки с образованием полноценного компоста.
8.	Внедрение предлагаемого способа утилизации лигноцеллюлозных субстратов позволит ликвидировать многотоннажные отходы, что, в конечном итоге, будет способствовать рациональному использованию лесных ресурсов и повышению экологической безопасности природной среды.

 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Удобрение из ГЛ (компост), показавшее высокую эффективность в полевых испытаниях, может в дальнейшем стать одним из основных органо-минеральных удобрений под пропашные культуры на территориях, прилегающих к гидролизным заводам.
2. Использование составленной ассоциации макромицетов, способной в короткие сроки деструктировать древесные опилки, дает возможность получить полноценный компост из отходов деревообработки.
3. Наличие в культуральных фильтратах дереворазрушающих грибов биологически активных веществ, аналогичных фитогормонам, позволяет использовать их в качестве регуляторов роста растений.
4. Разработанный метод энзимоиндикации может быть рекомендован для оценки зрелости компоста из ГЛ.
5. Переработка лигноцеллюлозых отходов в удобрение позволяет решить одну из наиболее острых экологических проблем промышленных регионов, связанных с накоплением многотоннажных отходов деревоперерабатывающих и гидролизных предприятий.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации
1. Волчатова И.В., Беловежец Л.А., Медведева С.А. Микробиологическое и биохимическое исследование лигнокомпоста в процессе созревания // Микробиология. - 2002. - Т. 71. - № 4. – С. 545-549.
2. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Стимуляция развития растений культуральными жидкостями микроорганизмов // Владимирский земледелец. – 2004. - № 3-4. – С. 27.
3. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Эффективность лигнокомпоста в зависимости от его агрохимических и биологических показателей при выращивании зерновых культур // Агрохимия. – 2005. - № 1. – С. 38-43.
4. Волчатова И.В., Медведева С.А., Бутырин М.В., Беловежец Л.А. Продуктивность агроценозов при использовании продуктов биоконверсии гидролизного лигнина // Агрохимия. – 2005. - № 5. – С. 55-58.
5. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Ростстимулирующая активность фракций компоста на основе гидролизного лигнина // Агрохимия. – 2005. - № 7. – С. 29-35.
6. Волчатова И.В., Медведева С.А., Беловежец Л.А., Коломиец Э.И. Дрожжеподобные грибы – источник получения биологически активных добавок // Успехи медицинской микологии. - Т. 5.- М.: Национальная академия микологии. - 2005. – С. 185-186.
7. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Биологическая активность культуральных фильтратов лигнинолитических микроорганизмов // Земледелие. – 2006. - № 2. – С. 14-16.
8. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Микробиологическая сукцессия и ферментативная активность в процессе компостирования гидролизного лигнина // Тез. докл. конф. «Проблемы экологии». Иркутск. - 1999. – С. 5-7.
9. Волчатова И.В., Медведева С.А., Беловежец Л.А., Хорошева С.Г. Участие микроорганизмов в разложении гидролизного лигнина // Тез. докл. междун. конф. «Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия». Минск. - 2000. - С.157-158.
10. Волчатова И.В., Медведева С.А., Беловежец Л.А. Перспективы использования микроорганизмов для ускоренного компостирования древесных отходов // Матер. Рос. науч.-практ. конф. «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе». Иркутск. - 2002. – С. 199-201.
11. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Некоторые свойства компоста на основе гидролизного лигнина // Матер. конф. "Экологические проблемы промышленных регионов". Екатеринбург. - 2003. – С. 422-423.
12. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Возможность использования гидролизного лигнина в качестве органоминерального удобрения // Сб. матер. науч.-практ. конф. «Химия – XXI век: новые технологии, новые продукты». Кемерово. - 2003. – С. 87-89. 
13. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Динамика агрохимических показателей компоста на основе гидролизного лигнина // Матер. междун. научн. конф. «Закон Российской Федерации «Об охране озера Байкал» как фактор устойчивого развития Байкальского региона». Иркутск. - 2003. - С. 62-63.
14. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Изменение численности микроорганизмов почвы под действием экстрактов из компоста // Матер. междун. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск. - 2004. – С. 357-358.
15. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Изменение микробного сообщества и ферментативной активности почвы под действием экстрактов из компостов // Матер. межрегион. науч.-практ. конф. “Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование”. Иркутск. - 2004. – С. 11-14.
16. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Биологическая активность фенолокислот, выделенных из компоста // Матер. II Всерос. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». Барнаул. - 2005. – С. 658-661.
17. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Скрининг культур высших грибов для компостирования древесных отходов // Сб. докл. 4-го междун. конгресса по управлению отходами ВэйстТэк-2005. - Москва. - 2005. – С. 159-160.
18. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Влияние аминокислот, продуцируемых лигнинолитическими микроорганизмами, на развитие растений // Ресурсосберегающие технологии земледелия. Сб. докл. междун. школы мол. ученых и специалистов «Перспективные технологии для современного сельскохозяйственного производства». Курск. - 2005. – С. 44-46.
19. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А., Петров А.Н. Скрининг новых лигнинолитических микроорганизмов // Матер. междунар. научн. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск – Раков. - 2006. – С. 66-68. 
20. Волчатова И.В., Медведева С.А., Беловежец Л.А. Научные основы применения биотехнологии для утилизации органических отходов природного происхождения // Матер. 4 съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино. - 2006.- С. 39-40.

Подписано в печать18.04.07.Формат 60х90х16.
Бумага писчая белая.Печать RIZO .Усл.печ.л.1.0.
Тираж 100экз.
Заказ № 31.Отпечатано в ИЗК СО РАН.